电解强化人工湿地处理城市污水处理厂尾水中微生物群落分析
摘 要：一个新型的电解人工湿地能够成功地对污水处理厂尾水中的氮、磷进行深度脱除，但其中的微生物机理和人工湿地对受水河道微生物生态的影响还远未清楚。采用高通量测序和网络分析对电解强化人工湿地中的功能微生物群落进行了研究，结果显示，电解强化人工湿地中有大量的自养型反硝化功能菌，从而保障了在低碳氮比下污水处理厂尾水中氮的脱除。经网络分析还发现，经过电解强化人工湿地后，污水处理厂尾水中的细菌群落与受水河道有显著差异，人工湿地可在污水处理厂与自然水体间起缓冲作用，更有利于减少污水处理厂尾水对自然水体的生态扰动。
关 键 词：风景园林；电解强化人工湿地；污水处理厂尾水；细菌群落；脱氮；网络分析
文章编号：1000-6664(2018)06-0049-05
中图分类号：TU 986
文献标志码：A
收稿日期：2018-04-19
修回日期：2018-04-25
基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项(编号2017ZX07204002)资助
通信作者(Author for correspondence) E-mail: [email protected]
Abstract: A new electrolysis intensified constructed wetland (E-CW) had been constructed for the deep treatment of waste water treatment plants (WWTP) effluent; however, the bacterial communities and activities in this kind of CWs were far from clear. Using high-throughput sequencing and network analysis, the bacterial community associated with nutrient removal was analyzed. The results showed that E-CW harbored large amount of denitrifiers which ensured the removal of nitrogen in WWTP effluent. Furthermore, the difference of dominant OTUs and separated module as shown by network analysis demonstrated minor influence of WWTP bacterial on receiving river.
Key words: landscape architecture; electronic augmented wetland; WWTP effluent; bacterial community; denitrification; network analysis
湿地是指每年在足够长的时间内均具有浅的表层水面，能维持大型水生植物生长的生态系统，包括沼泽地或其他水域地带，由湿地植物、动物、微生物以及环境共同组成，具有保护生物多样性及降解污染、净化水质的功能。人工湿地是一种根据天然湿地的净化原理，模拟天然湿地，人工建造的一种污水净化系统，通过在人工铺设的基质上种植浮水、挺水及沉水植物，联合微生物群落，通过物理、化学和生物的多重作用达到去除污染物，净化水质的目的。1903年在英国的约克郡Earby，建成了首个用于污水处理的人工湿地[1]。由于人工湿地系统模拟自然，多由自然生物组成，因此其不仅具有生态处理功能，同时可以与美学设计相结合，使得人工湿地兼具景观功能。1998年，中国建有世界上第一个城市湿地公园——成都活水公园[2]。2004年起，我国开始了大规模的城市湿地公园建设。人工湿地因其独特的景观功能，较其他污水处理系统有很强的优势。
随着国民经济的发展和环保意识的增强，越来越多的工业和生活污水被接管收集到污水处理厂进行集中处理以去除其中的COD、氮和磷。但是污水处理厂尾水中的总氮(TN)依然高达15mg/L[3]，远超地表V类水中的TN指标(2mg/L)。因此，污水处理厂尾水若被直排到河道中，仍有可能造成水体富营养化等一系列问题。同时，污水处理厂尾水存在着碳氮比低、碳源多为难降解碳源的问题，用常规的氮磷深度脱除方法缺乏经济性[4]。人工湿地可以被用于污水处理厂尾水的深度处理，但是常规的人工湿地不仅占地面积大，而且存在着处理效率低的问题，在水力停留时间较短的情况下，并不能很好地进行氮磷的深度脱除。针对这些问题，本研究采用了一种新型的人工湿地——电解强化人工湿地(Electrolysis intensified constructed wetland，E-CW)，这种人工湿地通过联结电解强化技术，可以有效实现尾水中氮、磷的高效去除。E-CW是在原有人工湿地的基础上添加正负电极，采用外源供电的方式达到高效脱氮除磷的目的。脱氮过程主要包括电化学脱氮和由电极引起的化学氧化。电化学脱氮主要通过在电极阳极上的氨氧化作用和在阴极上的反硝化作用实现，而化学氧化是由次氯酸或羟基自由基引起的将氨氮氧化为N2的过程。在电化学脱氮的过程中会生成NH4 +-N、NO2 --N等副产物，如何通过选择适当的电极和控制适宜的操作条件是实现高效脱氮的关键。电化学除磷则主要通过铁、铝等阳极材料电解得到的金属阳离子或其水合离子与磷酸盐的絮凝沉淀作用实现[5]。电化学过程通过电子的传输实现人工湿地脱氮除磷的方法相较于其他强化方式，如增加曝气量，添加外源碳源或外源氧化还原剂等，具有更加经济、不造成二次污染等优势。已有研究表明，电解强化人工湿地可以实现高效的脱氮除磷[5]。
在人工湿地中有机和无机污染物的去除主要依赖于微生物作用[6-8]，如微生物降解、矿化、硝化和反硝化作用。因此，通过对电解强化人工湿地中微生物脱氮除磷机制的认识，可以对人工湿地进行设计和调控，从而提高氮磷的去除性能[9]。除此以外，微生物的结构特征还影响其生态功能。在污水处理厂对生活污水进行处理的过程中，可能会导致病原菌、抗生素抗性基因等在尾水中进行富集，若尾水不经过后期的处理就直接排放到河道中，可能会造成相应的生态危害。而人工湿地在承担着对污水深度低耗处理功能的同时，还可以对其中微生物群落结构进行调整，起到生态调节的作用。因此在本研究中同样需要关注的是，通过采用人工湿地进行尾水处理，能否在降低氮磷浓度的同时起到生态缓冲作用，减少污水处理厂的尾水对受水河道的自然菌群的影响。
图1 漕桥污水处理厂尾水深度处理人工湿地布置
1 材料和方法
1.1 电解强化人工湿地
电解强化人工湿地建造于江苏常州漕桥污水处理厂(31°31'30.80'' N, 120°00'47.40'' E)。利用污水处理厂内空置土地建设人工湿地(图1)，面积为6000m2，湿地平均水深1.5m，水力停留时间为17.5h。在湿地建造中，采用挖土和堆填的方式，建造2个人工岛屿，并建造木制廊桥连接，营造景观，且利于湿地管理。污水处理厂二沉池出水直接进入人工湿地，在人工湿地中，为了提高水力停留时间，采用橡胶坝进行分隔。人工湿地进水首先经过电解强化单元和微生物强化单元进行强化净化，其中电解强化人工湿地采用太阳能供电，供电电压为20V，采用铁棒为电极。同时在人工湿地中配置3 500m2的水生植物，包括香蒲、芦苇、水竹芋、苦草、圆币草、粉绿狐尾藻等。经过一年的连续运行，可以对污水处理厂尾水中的氮、磷进行有效脱除。
1.2 净化效果测定
对污水处理厂(A)、湿地进水(B)、湿地出水(C)和受水河道(D、E)分别采样，其中点A采集活性污泥样品，其余各点采集水样。自电解强化人工湿地建成起至第300d，每15d采集各点样品，测定其中的TN、NH4 +-N、NO3 --N、TP、PO4 3--P和COD浓度以考察电解强化人工湿地对COD、氮和磷的处理效果。
1.3 DNA提取和Illumina MiSeq高通量分析
采用高通量测序技术，分析污水处理厂尾水经过人工湿地前后，其细菌群落结构和功能群的变化特征及尾水经处理后对受水河道的影响。首先将500mL水样过0.2μm聚碳酸酯滤膜(Millipore, 47mm)，泥样称取0.5g后，分别采用试剂盒FastDNA® spin kit for soil(MP Biomedicals, CA, USA)对其中的微生物进行DNA抽提。所得DNA采用NanoDrop® ND1000(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE，USA)进行质量检测，并将所得DNA样品送至凌恩生物用Illumia MiSeq平台进行高通量测序和生物信息学分析。
1.4 统计和网络分析
采用CANOCO软件进行主成分(Principal Component Analysis，PCA)分析。为进一步探索功能细菌与氮磷去除的关系，采用Cytoscape plugin CoNet(http://psbweb05. p s b . u g e n t . b e / c o n e t /，h t t p : / / a p p s . cytoscape.org/apps/cytocluster)进行共存网络分析，以了解细菌之间及细菌与环境因子之间的相关关系，并用Gephi实现网络关系的可视化。
图2-1 不同样品中细菌群落在门水平组成
图2-2 不同样品在门水平上PCA分析与主要影响的细菌门(A——活性污泥，B——人工湿地进水，C——人工湿地出水，D——排口下游河道，E——排口上游河道)2 结果和讨论
2.1 电解强化人工湿地的处理效果
表1显示的是电解强化人工湿地300d内对COD、氮和磷的处理效果。从表1可见，电解强化人工湿地对总氮和总磷的去除效果较好，去除率达到了47.6%和32.0%。尤其是在碳氮比仅为4左右的情况下，能够实现高效的氮去除。这对深度净化污水处理厂尾水，保护自然水体，减少富营养化的产生非常有意义。
2.2 细菌群落组成和结构
根据高通量测序结果，测序相关信息及计算得到的多样性指数如表2所示。其中每个样品的Good覆盖率都在0.99以上，说明测序深度已经能够覆盖样品中所有的细菌群落。操作分类单元(Operational taxonomic units，OTU)是在系统发生学或系统遗传学的研究中，为了便于分析，将具有一定相似性的序列归为一类，每类即为一个OTU。本研究将具有97%相似性的序列归为一类，而后通过与Silva数据库[10](http://www.arb-silva.de)比对得到物种分类学分析，进而进行后续的生物信息统计分析。根据得到的OTU信息，采用mothur软件计算α多样性指数，包括ACE指数、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数。α多样性指数主要反映环境样品内的物种多样性，多样性指数越高，代表物种多样性越高。表2中，OTU在污泥、E - C W和河道中的最大数量分别为476，493-529和463-487，在E-CW中细菌的多样性最高，ACE、Chao1与Simpson指数也显示相似的结果，虽然Shannon指数显示E-CW中的α多样性却较低。多样性的不同可能与营养物质的浓度、化学计量比以及细菌间的相互作用有关。因此要考察经人工湿地处理后的出水是否会对自然水体中的微生物群落产生影响，进而影响自然水体的生态功能还需进一步的分析。
聚类分析通过对各样品群落组成之间的距离进行计算，将群落结构相近的聚在一起，此研究中采用的是bray-curtis距离。通过聚类分析显示，在门水平上，E-CW进水(B)和出水(C)聚在一起，河道水体(D和E)聚在一起，而污泥样品(A)单独成为一簇。这表明即使污水处理厂、E-CW与河道之间存在着水体的交换，但是各位置水体的微生物群落组成之间依然差距较大，各位置的微生物结构仍然保持着各自的异质性，同时也说明污水处理厂尾水对E-CW和河道水体中微生物群落的组成和结构的扰动较小。同时在门水平上(图2-1)也可以明显地看出，这3个样品中的微生物群落结构也有明显的差异。再采用PCA分析对5个点的微生物群落进行分析，如图2-2所示，B、C之间的距离较近，D、E之间的距离较近且都与A分离，再一次说明不同样品中的特征细菌在门水平上的显著差异。这种差异与生物和环境因子的差异密切相关[11-12]，特别是在不同的微环境和生态位上不同的细菌种属得到富集。
进一步分析样品中所含的细菌，发现在所有样品中变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)均占优势(图2)。在变形菌门中，ε-变形菌在E-CW中的丰度更高，但大部分都为弓形杆菌属(Arcobacter)(图3)。弓形杆菌属在环境中广泛存在，并且部分种为人畜致病菌[13]。这可能是因为在湿地中存在着野鸭和水鸟等野生动物，它们的粪便排泄造成了条件致病菌的增加。今后如何在湿地管理中减少条件致病菌对环境的影响还需要进一步研究。
进一步地，在属的水平上，所有的O T U隶属于6 7 3个属，其中D e c h l o r o m o n a s是一种常见的反硝化菌，其在E - C W中的丰度(3.28%，2.19%)甚至高于活性污泥(0.34%)，说明Dechloromonas在E-CW的脱氮过程中可能发挥重要作用。同时Malikia也在E-CW中得到富集，尽管目前对其研究还较少，但已发现它与自养脱氮菌Hydrogenophaga[14]的功能类似，因此推测其也为一种脱氮细菌。说明在电极的作用下，脱氮细菌在E - C W中发生了富集作用，而这些脱氮细菌的富集保障了E - C W的脱氮活性。而在河道中的微生物优势种属则基本属于天然水体的常见类型，如Cyanobacteria、Limnohabitans和Polynucleobacter。这也说明污水处理厂的尾水在经过E-CW的处理后对天然水体中微生物群落结构几乎不产生扰动。
微生物的群落结构受到外源物质输入的影响，而微生物群落结构的演替又影响着生态系统的功能。在以往的研究中发现，污水处理厂尾水的排放会影响受水河道中微生物的群落结构[15-16]，而我们的结果表明了在经过人工湿地后，污水处理厂尾水中的微生物对自然水体的影响较小，这也消除了活性污泥中可能被富集的致病菌和抗性基因对环境的潜在风险。
2.3 微生物共存生态网络分析
为分析细菌群落和环境间的关系，进行了细菌和环境因子间的共存网络分析。图4显示的分别为细菌在OTU(图4-1、4-2)水平上的共存网络分析。从OTU水平的网络聚类结果来看，细菌被聚类为3个模块，模块I以活性污泥中的细菌为主，模块II以河道中细菌为主，而模块III以E-CW中的细菌为主。模块的形成是由于不同的生态位[17-18]，而聚在同一模块的细菌通常具有类似的功能或在功能上存在着密切的相互作用。因此，网络分析的结果再次证实了微生物群落结构在活性污泥、人工湿地和受水河道间存在着显著的差异，这种差异可能是因为栖息环境对微生物群落结构的影响超过了水体间微生物的交换。但在纲水平上的网络分析结果却显示只有模块I和模块II的细菌仍然聚在了一起，而模块III的细菌却没有形成明显的聚类，这也表明了人工湿地中的细菌生态位处于高处理能力的活性污泥与自然水体之间。
图3 各样品中的优势属(A——活性污泥，B——人工湿地进水，C——人工湿地出水，D——排口下游河道，E——排口上游河道)3 结论
污水处理厂尾水含氮浓度较高，若直接排入自然水体可能会引起水体富营养化。电解强化人工湿地在对低碳氮比、碳源较难利用的尾水的处理方面具有相当的优势。本研究通过分别考察污水处理厂，电解强化人工湿地与河道水体系统中的COD、氮与磷的浓度，并结合高通量测序技术与共存网络分析，探究得到电解强化人工湿地中存在脱氮细菌的富集，可以有效地去除尾水中的氮。且尾水的注入不会对人工湿地与河道水体中的微生物群落产生较大的影响，人工湿地在污水处理厂与自然水体之间形成缓冲，减轻了污水处理厂尾水对自然水体的影响。
注：文中图片均由作者绘制。
图4 细菌OTU(4-1)和纲水平(4-2)的共存网络分析
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作者简介：
陈慧萍
1994年生/女/安徽安庆人/南京大学环境学院环境科学专业在读硕士研究生/研究方向为环境微生物生态学，环境污染生物修复技术(南京 210046)
路俊玲
1994年生/女/山东青岛人/南京大学环境学院环境科学专业在读硕士研究生/研究方向为环境微生物生态学，环境污染生物修复技术(南京 210046)
肖 琳
1973年生/女/安徽宿州人/博士/南京大学环境学院环境科学系教授，博士生导师/研究方向为环境分子生物学，微生物生态学，环境污染生物修复和技术开发(南京 210046)